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                傷口愈合實驗-干細胞侵襲

                更新時間:2016-05-26   更新時間:2016-05-26   點擊次數:3434次

                傷口愈合實驗是體外研究細胞遷移的的一個有用的實驗。原理是人為的在鋪板的單層細胞中制造一個空白的無細胞的地帶,然后對這個無細胞地帶的邊緣的細胞進行觀察;這些邊緣的細胞會開始進行遷移活動,并且終覆蓋整個無細胞的區域,重新互相接觸在一起。法國的科研人員在2015年的 STEM CELL上發的文章中提出神經生長因子(NGF)和神經生長因子前體(proNGF)會自動的激活乳腺癌干細胞,并且發生侵襲。文中,使用乳腺癌細胞系和腫瘤分離的細胞進行傷口愈合實驗,得出,由NGF處理的腫瘤離的乳腺癌細胞的傷口愈合速率有非常顯著的提高。說明在NGF能促進乳腺癌細胞遷移活動。

                 

                Nerve Growth Factor and proNGF Simultaneously Promote Symmetric Self-Renewal, Quiescence, and Epithelial to Mesenchymal Transition to Enlarge the Breast Cancer Stem Cell Compartment

                E. Tomellini, Y. Touil, C. Lagadec, S. Julien, P. Ostyn, N. Ziental-Gelus, S. Meignan, J. Lengrand, E. Adriaenssens, R. Polakowska and X. Le Bourhis

                STEM CELLS, 2015, 10.1002/stem.1849

                 

                在文中,使用Ibidi開發的傷口愈合插件進行了傷口愈合實驗。這是一種雙孔的硅膠插件,可以放在培養皿中,插件兩孔間的孔壁寬度為500μm。將細胞種在插件中,等待細胞貼壁長滿后,將插件移除,這樣,兩孔間的縫隙就是一個無細胞的劃痕

                 

                 

                1. 實驗材料
                • 細胞:     MCF-7 、腫瘤分離細胞
                • 實驗耗材:   傷口愈合插件培養皿 (ibidi, 81176) 
                • 細胞培養基:  MEM medium
                • 試劑:  EGF  sigma, E9644

                           bFGF R&D233-FB

                           NGF  Scil Protein

                           proNGF Alomone LabsN-285

                • 滅菌鑷子

                 

                1. 實驗步驟
                1. 鋪細胞(圖三)
                • ibidi傷口愈合培養皿底部的保護膠帶撕除。
                • ibidi細胞插件的每孔中加入× 104的細胞懸液。注意不要大力晃動培養皿。以防止細胞不均勻。
                • 37C培養箱中孵育24小時。

                 

                 

                圖三:A. 去除培養皿底部的保護膠帶。B.C.ibidi傷口愈合插件中加入細胞。

                 

                1. 形成劃痕
                • 采用無血清MEM培養基培養細胞4小時
                • 如圖四所示,小心的用鑷子夾住插件的一個角,將插件移除。 

                  

                • 移除插件后,要用顯微鏡檢查是否形成合格的劃痕
                • 小心的清洗細胞,之后加入2ml培養基進行培養(圖五)。

                 

                 

                1. 采集并分析圖像
                • 在顯微鏡下選取能同時看到劃痕和兩邊細胞的視野進行成像,劃痕的方向好是水平或者垂直。
                • 采集0h4h的圖像,并且分析每張圖的細胞覆蓋劃痕區的面積。

                 

                 

                (三)實驗結果

                 

                 

                如圖所示,ML表示MCF-7 細胞系。腫瘤分離細胞團分別由EGFbFGFNGFproNGF處理,由t-EGF/bFGFt-NGFt-proNGF表示。可以看到由NGF處理的細胞,在4h的時候覆蓋面積大,遷移速率快。